Главная страница Карта сайта Контактная информация

Главная » Научные группы »

Изучение молекулярных основ онкогенеза

Общая информация


Группа работает на биологическом факультете в составе лаборатории молекулярной биологии под руководством ведущего научного сотрудника Михаила Александровича Рубцова (к.347). Ведется работа по двум направлениям, посвященным молекулярным основам онкогенеза:

  1. Механизмы индукции вторичных лейкозов, вызванных химиотерапевтическими препаратами. Клеточные модели лейкозов.

  2. Изучение белков клеточной адгезии, их роли в метастазировании, а также создание адресующих в клетки опухоли молекул для медицинского применения.

1. Механизмы индукции вторичных лейкозов, вызванных химиотерапевтическими препаратами. Клеточные модели лейкозов.

Особенности группы

Группа изучает механизмы возникновения вторичных лейкозов. Для этого на основе клеток человека создаются клеточные линии: осуществляется редактирование генома клеток с помощью систем CRISPR/Cas и TALEN и осуществляется получение клеточных линий из трансфицированных клеток. Также создаются клеточные линии для моделирования лейкозов с участием протоонкогена MLL. Помимо методов, стандартных для молекулярной и клеточной биологии, используются FISH и конфокальная микроскопия.

Вторичные лейкозы

Возникновение лейкозов — один из побочных эффектов химиотерапии опухолей. Раковые клетки, которые быстро делятся, чувствительны к химиотерапевтическим препаратам, индуцирующим двуцепочечные разрывы ДНК. В здоровых клетках системы репарации справляются с повреждениями, но при этом репарация идет чаще всего по пути негомологичного соединения концов разрыва (NHEJ). Такой механизм допускает ошибки: могут соединиться совсем не те концы, что были результатом одного разрыва. Иногда так соединяются фрагменты разных хромосом, и получаются хромосомные транслокации, приводящие к раковой трансформации клетки. Лейкозы, возникшие по такому пути из-за химиотерапии, называют вторичными, обусловленными лечением (t-AML, Therapy-related Acute Myeloid Leukemia).

Подвижность протоонкогенов

Чтобы хромосомная транслокация стала причиной лейкоза, на рекомбинантных хромосомах в месте соединения должны оказаться определенные гены. Так происходит, если в этих генах одновременно будут внесены разрывы, и их концы сблизятся в пространстве ядра. Тогда они могут соединиться, образовав лейкозогенную хромосомную перестройку.

Наша группа изучает, как двигаются протоонкогены в ядре при обработке клеток химиотерапевтическими препаратами, и как эту подвижность можно уменьшить. Методы исследования — FISH, конфокальная микроскопия и последующий компьютерный анализ изображений.

Компьютерный анализ конфокальных снимков.
Компьютерный анализ конфокальных снимков.


Клеточные модели возникновения транслокаций

Лейкозогенные транслокации — крайне редкое событие, они возникают в единичных клетках популяции. Поэтому для изучения механизмов транслокаций в нашей группе создают клеточные модели — интегрируют в геном клеток систему CRISPR/Cas9 и контролирующую систему TetON. В полученных трансгенных клетках по сигналу извне ген эндонуклеазы Cas9 начинает экспрессироваться, и Cas9 вносит разрывы в два определенных локуса. Репарация с некоторой вероятностью приводит к транслокациям между локусами, в которые внесены разрывы. В результате у многих клеток в культуре образуются искомые транслокации, которые можно отследить с помощью простой ПЦР.

Трансфекция клеток плазмидными конструкциями для создания клеточной модели транслокаций.
Трансфекция клеток плазмидными конструкциями для создания клеточной модели транслокаций.


Эту систему индукции хромосомных перестроек можно использовать для изучения механизмов образования транслокаций. Другим применением является скрининг потенциальных лекарств, снижающих риск возникновения хромосомных транслокаций, и, как следствие, вторичных лейкозов.

ВИЧ-ассоциированные транслокации

Также в рамках совместной российско-французской лаборатории «Laboratoire International Associe № 1066 Laboratoire Franko-Russe de Recherche en Oncologie» сотрудники группы изучают механизмы, лежащие в основе ВИЧ-ассоциированных хромосомных транслокаций. Было обнаружено, что вирусный белок Тат, циркулирующий в крови больных, проникает в ядра лимфоцитов, где стимулирует возникновение разрывов внутри генов IgH и СMYC. Последующая релокализация в ядре гена СMYC приводит к тому, что он оказывается рядом с IgH. Перестройка между этими двумя генами приводит к развитию лимфомы Беркитта. Для изучения этого явления были созданы: клеточная линия, в которой индуцируются разрывы в локусах IgH и СMYC, а также линии, в которых индуцируются разрывы только лишь в IgH или СMYC.

Клеточные модели, содержащие транслокации с участием MLL

Перестройки с участием гена MLL (KMT2A) встречаются приблизительно в 10% случаев острых лейкозов со значительным преобладанием в группе детей младше 1 года. Диагностика и терапия этих лейкозов осложняется высокой гетерогенностью хромосомных перестроек – у разных пациентов обнаруживаются как различные гены-партнеры MLL, так и различные точки разрыва внутри самого MLL.

Для гена MLL известно более 90 генов-партнеров по хромосомным транслокациям. Чтобы разобраться, почему генов-партнеров так много, мы получаем клетки с различными транслокациями с участием MLL. Мы моделируем транслокации, варьирующие от хорошо изученных и часто встречающихся до тех, про белковый продукт которых до сих пор ничего неизвестно, чтобы выявить и сравнить изменения их пролиферативных свойств и морфологических характеристик. Для выяснения молекулярных механизмов онкогенеза будет проанализировано изменение транскриптома, а также определен характер эпигенетических меток, таких как уровень метилирования гистонов в районе генов, экспрессия которых будет меняться после возникновения транслокации.

В составе группы работают:

2. Изучение роли белков клеточной адгезии в метастазировании опухолей. Создание для медицинского применения молекул, адресующих в клетки опухоли

Роль гликопротеида MUC1 в метастазировании

В рамках этого направления были созданы клеточные модели — «искусственные метастазы» для исследования роли экстрацеллюлярного домена известного гликопротеида MUC1 в метастазировании. Считается, что данный белок гиперэкспрессирован в раковых клетках железистых органов и влияет на их способность к метастазированию. Однако данное влияние исследовано слабо по причине отсутствия адекватных клеточных моделей. В лаборатории были созданы клеточные линии, презентирующие на поверхности различные варианты домена муцина MUC1. Для оценивания их метастатического потенциала измеряется их способность к миграции сквозь слой искусственно выращенного эндотелия сосудов (HUVEC, трансэндотелиальная миграция in vitro).

Сконструированные различные варианты гликопротеида MUC1.
Сконструированные различные варианты гликопротеида MUC1.


Белок SAV-RGD: стрептавидин, слитый с меланома-адресующим RGD-пептидом

В нашей лаборатории был получен рекомбинантный белок SAV-RGD, содержащий стрептавидин и меланома-адресующий RGD-пептид, и продемонстрирована способность этого белка узнавать клетки меланомы человека (MeWo, MelCher). Также была установлена его основная мишень — интегрин αvβ3. Связывание с таким белком вызывает кластеризацию рецепторов на поверхности клеток меланомы, интернализацию белка и приводит к снижению выживаемости таких клеток. В сотрудничестве с РОНЦ им.Блохина в 2014 г были успешно закончены доклинические исследования потенциального препарата.

В составе группы работают:

3. Изучение и реконструкция в микроорганизмах стероид-продуцируюущих систем млекопитающих

По этому направлению группа сотрудничает с НИИ ФХБ им.Белозерского и с белорусскими коллегами в рамках международного гранта РФФИ. Удалось создать серию векторов, позволяющих экспрессировать три отдельных белка в форме самопроцессирующегося полипотеина, реконструировать холестерин гидроксилазно-лиазную систему млекопитающих в клетках бактерий и дрожжей и добиться ее неплохой активности. Это открывает возможность синтеза фармакологически значимых стероидных препаратов биотехнологическим способом, что на порядки дешевле и эффективнее современных методик химического синтеза.

В составе группы работают:

Методы

Работа с культурами клеток млекопитающих, редактирование генома с помощью TALEN и CRISPR/Cas, получение стабильных клеточных линий, метод 3D FISH, конфокальная микроскопия, in vivo микроскопирование клеток, стандартные молекулярно-биологические методы работы с нуклеиновыми кислотами (выделение, разновидности ПЦР) и белками (колоночная хроматография, электрофорез, иммунохимия), получение рекомбинантных плазмидных конструкций методами Golden Gate, Gibson Assembly, рестрикционного клонирования.

Сотрудничество с зарубежными лабораториями


Группа сотрудничает с лабораторией «Хроматин, биология развития и рак» Института Канцерогенеза им. Густава Русси (CNRS, Вильжуиф, Франция).

В рамках сотрудничества создана совместная русско-французская лаборатория.

Студенты-дипломники (за последние 5 лет)


2014

  • Николай Ломов, специалист — «Характеристика позиционирования протоонкогенов в ядре в условиях ингибирования ДНК-топоизомераз»
  • Юлия Кондратенко, специалист — «Исследование влияния функциональных доменов муцина MUC1 на метастатический потенциал опухолевых клеток человека in vitro»

2015

  • Екатерина Лучкина, бакалавр — «Роль RGD-связывающих интегринов в малигнизации опухолевых клеток».

2016

  • Валерия Зинина, бакалавр — «Влияние функциональных доменов муцина MUC1 на метастатический потенциал опухолевых клеток человека»
  • Анастасия Петушкова, бакалавр — «Исследование ферментативной активности рекомбинантной папаин-подобной протеиназы пшеницы тритикаин-альфа»
  • Анастасия Лабудина, бакалавр — «Экспрессия белков холестерингидроксилазной/лиазной системы в форме самопроцессирующегося полипротеина в клетках эукариот»

2018

  • Владимир Вьюшков, бакалавр — «Создание клеточной модели ассоциированных с лейкозами хромосомных транслокаций»

Контакты

  • Михаил Александрович Рубцов (ma_rubtsov@mail.ru), руководитель группы
  • Марина Сергеевна Сыркина (krimsy@yandex.ru), сотрудник
  • Николай Андреевич Ломов (vk.com/lomov13), сотрудник
  • Владимир Сергеевич Вьюшков (vk.com/id48023485), студент-магистр

Расположение

3 этаж, кафедра молекулярной биологии, к.345а, 345, 347:



версия для печати







© 2019 Кафедра молекулярной биологии
Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
- создание сайта,
                         v1.2005, v2.2012