Изучение молекулярных основ онкогенеза

Возникновение лейкозов — один из побочных эффектов химиотерапии опухолей. Раковые клетки, которые быстро делятся, чувствительны к препаратам, индуцирующим двуцепочечные разрывы ДНК. В здоровых клетках системы репарации справляются с такими повреждениями. Однако репарация чаще всего идет по пути негомологичного соединения концов разрыва. Такой механизм допускает ошибки: могут соединиться совсем не те концы, что были результатом одного разрыва. Иногда так соединяются фрагменты разных хромосом, и получаются хромосомные транслокации, приводящие к раковой трансформации клетки. Лейкозы, возникшие как следствие химиотерапии, называют вторичными, обусловленными лечением (t-AML, Therapy-related Acute Myeloid Leukemia). Наша группа изучает механизмы, которые определяют формирование транслокаций, ведущих к этим заболеваниям.

Чтобы хромосомная транслокация стала причиной лейкоза, на перестроившихся хромосомах в месте соединения должны оказаться определенные гены. Так происходит, если в этих генах одновременно будут внесены разрывы, и концы разрывов окажутся в одном месте ядра. С помощью флуоресцентных зондов мы визуализировали перестраивающиеся гены и их хромосомы. Препараты анализировали на конфокальном микроскопе с последующим компьютерным анализом изображений. Также с помощью метода 4С (захват конформации хромосом с последующим высокопроизводительным секвенированием) изучали пространственные контакты перестраивающихся генов с другими участками генома. Наконец, для изучения формирования транслокаций мы создаем клеточные модели.

Изучение целостности и подвижности, а также профилей пространственных контактов гена AML1, часто перестраивающегося при вторичных лейкозах вследствие терапии этопозидом. FISH — флуоресцентная in situ гибридизация, 4С-seq — метод изучения пространственных контактов хромосом (от circular chromosome conformation capture). Результаты показывают, что AML1 рвется под действием этопозида, и разрывы приобретают повышенную мобильность, что позволяет перестраиваться между собой генам, которые изначально не были сближены в ядре.

Также в рамках совместной российско-французской лаборатории «Laboratoire International Associe №1066 Laboratoire Franko-Russe de Recherche en Oncologie» сотрудники группы изучают механизмы, лежащие в основе ВИЧ-ассоциированных хромосомных транслокаций. Было обнаружено, что вирусный белок Тат, циркулирующий в крови больных, проникает в ядра лимфоцитов, где стимулирует возникновение разрывов внутри генов IgH и СMYC. Последующая релокализация в ядре гена СMYC приводит к тому, что он оказывается рядом с IgH. Перестройка между этими двумя генами приводит к развитию лимфомы Беркитта. Для изучения этого явления были созданы: клеточная линия, в которой индуцируются разрывы в локусах IgH и СMYC, а также линии, в которых индуцируются разрывы только лишь в IgH или СMYC. Полученные клеточные линии используются для изучения влияния реактивации (перехода из латентной в литическую фазу инфекции) вируса Эпштейна-Барр на вероятность развития лимфомы Беркитта.

Перестройки с участием гена MLL (KMT2A) встречаются приблизительно в 10% случаев острых лейкозов со значительным преобладанием в группе детей младше 1 года. Диагностика и терапия этих лейкозов осложняется высокой гетерогенностью хромосомных перестроек – у разных пациентов обнаруживаются как различные гены-партнеры MLL, так и различные точки разрыва внутри самого MLL.

Для гена MLL известно более 90 генов-партнеров по хромосомным транслокациям. Чтобы разобраться, почему генов-партнеров так много, мы получаем клетки с различными транслокациями с участием MLL. Мы моделируем транслокации, варьирующие от хорошо изученных и часто встречающихся до тех, про белковый продукт которых до сих пор ничего неизвестно, чтобы выявить и сравнить изменения их пролиферативных свойств и морфологических характеристик. Для выяснения молекулярных механизмов онкогенеза будет проанализировано изменение транскриптома, а также определен характер эпигенетических меток генов, экспрессия которых будет меняться после воз никновения транслокации.

Работа ведется в сотрудничестве с лабораторией цитогенетики и молекулярной генетики НМИЦ детской гематологии, онкологии и гематологии ДГОИ им. Дмитрия Рогачева.

Такие клеточные модели создаются с помощью систем для прижизненного наблюдения за динамикой локусов, таких как система ParB/Int (ANCHOR) и системы CRISPR-имаджинга. Система ANCHOR основана на компонентах сегрегации бактериальных хромосом INT—ParB и состоит из двух основных элементов: специальных якорных последовательностей и узнающих их белков. Последовательность ANCH интегрирована в изучаемый локус. Бактериальные белки OR, слитые с флуоресцентным белком, узнают эту последовательность и олигомеризуются на ней, позволяя наблюдать in vivo за перемещением локуса с помощью микроскопии. Преимущество системы заключается в том, что интеграция ANCH в изучаемые локусы не влияет на их естественную динамику в ядре.

Технология может быть адаптирована для микроскопии сверхвысокого разрешения, что позволит изучать архитектуру хроматина на более тонком уровне, чем возможно с помощью традиционной конфокальной микроскопии.

Визуализация локуса MYC. A — наложение изображений в проходящем свете и в канале флуоресценции GFP. Б, В — конфокальные плоскости, в которых находятся 2 аллеля гена MYC. Г — трехмерная реконструкция клетки.

Другой перспективный метод наблюдения за локусами ядра в живой клетке — CRISPR-имаджинг. Он базируется на использовании каталитически неактивной Cas9 (dCas9), которая привлекается к локусу-мишени с помощью гидовой РНК. Наша группа применяетодну из таких технологий — CRISPR-Sirius. В ней для усиления яркости сигнала к последовательности гидовой РНК добавляются аптамерные модули — РНК-шпильки бактериофагов MS2 и PP7, с которыми связываются белки этих бактериофагов (MCP и PCP), слитые с флуоресцентными белками.